Jeffrey Cross
Jeffrey Cross

Flashback: Makmal DNA Kaunter Dapur

Dengan Make: Bilik Sains kami dengan penuh, saya diingatkan mengenai isu Biologi Backyard of MAKE. Dalam Jilid 07, kami mempunyai artikel yang termasuk pembekuan dan menghidupkan semula siput taman, cara membuat makmal miokologi rumah, cantuman tanaman dan pendebungaan, bagaimana untuk mereplikasi DNA anda sendiri, dan sekeping batu asas, artikel Dr Shawn Carlson tentang bagaimana mengekstrak, memurnikan, dan bereksperimen dengan DNA. Sayangnya, anda tidak boleh mendapatkan kembali isu Volume 07 atau kotak Seterusnya Tahun Baharu bahawa ia adalah sebahagian daripada, tetapi di sini artikel Dr Shawn sepenuhnya untuk mendapatkan roda biologi anda beralih. Selain itu, jika anda seorang pelanggan, anda mendapat akses penuh ke semua 20 isu-isu belakang yang MEMBUAT melalui Edisi Digital kami. Dan pastikan anda melangkah ke Make: Bilik Sains untuk lebih banyak projek, alat, dan teknik untuk saintis halaman belakang.

Makmal DNA Kaunter Dapur Oleh Dr Shawn

DNA mungkin struktur yang paling luar biasa dalam semua ciptaan. Helix ganda yang terkenal adalah molekul terpanjang yang diketahui dan mengawal proses kehidupan di setiap sel di Bumi. Lebih-lebih lagi, kod yang membawa DNA adalah pelan tindakan sebenar kehidupan itu sendiri. Resipi manusia, contohnya, terdiri daripada kira-kira 3 bilion bit molekul maklumat yang dibentangkan dalam urutan yang tepat. Mungkin yang paling menakjubkan, tangga menggerunkan ini secara langsung menghubungkan setiap makhluk di Bumi ke masa lalu kuno dan biasa - jauh sekali ketika evolusi pertama mula membentuk bentuk biologi yang akhirnya akan memasuki dunia yang kita tahu hari ini. Dengan mengkaji perbezaan antara DNA dalam tubuh kita dan dalam organisma lain, kita dapat mengetahui kapan spesies kita tersebar dari simpanse, kera, dan bahkan ikan primordial.

Ciri-ciri molekul besar ini sangat misteri dan mengagumkan yang kebanyakan orang hanya menganggap keimamatan yang tercerahkan oleh ahli biologi makmal dapat mengekstrak dan mengkajinya. Tidak begitu. Malah, sesiapa sahaja boleh mengekstrak, memurnikan, dan bereksperimen dengan DNA di rumah.

Apabila dikeluarkan dari sel, DNA biasanya berpecah kepada filamen. Dalam penyelesaian, helai ini mempunyai caj elektrik yang sedikit negatif, yang membuat beberapa kimia sangat berguna. Sebagai contoh, bahagian yang lebih negatif dari satu helai DNA akan cenderung menarik lebih banyak kawasan yang positif. Ini menyebabkan molekul DNA bergumpal dan gugur dari larutan. Walau bagaimanapun, jika garam ditambah, ion positifnya tertarik kepada caj negatif DNA, dengan berkesan meneutralkannya. Ini menghentikan serpihan dari mematuhi dan menjadikannya terapung dalam larutan.

Oleh itu, dengan mengawal kepekatan garam, sesiapa sahaja boleh membuat serpihan DNA sama ada bersurai atau bergumpal bersama. Dan di dalamnya terdapat rahsia penting untuk memisahkan DNA dari sel-sel dan memanipulasinya di rumah.

Mengasingkan DNA: Pengekstrakan

Inilah cara ia berfungsi. Pertama, anda memerlukan penyelesaian masin, yang dipanggil penyangga, ke mana DNA boleh dibubarkan. Seterusnya, anda perlu memecahkan sekumpulan sel dan membiarkan "molekul" molekul mereka meresap ke dalam penampan anda. Kemudian, anda akan mahu menambah enzim khas yang akan memusnahkan molekul yang tidak diingini, seperti protein, yang mana akan menjejaskan hasil anda. Akhirnya, anda perlu mengurangkan kepekatan garam secukupnya untuk menyebabkan molekul DNA bergumpal dan gugur.

Untuk penampan:

Air sulingan atau botol air (kaca 1) 120ml (kira-kira 4 oz) Garam 1.5 gram (¼ sudu teh) 5 sudu besar baking soda (1 sudu teh) Pencuci pakaian cair, detergen pinggan atau syampu (kaca 2) pada label, 5ml (1 sudu teh) Hancur ais untuk menggenangkan penyangga Peminat daging Jus nanas, atau penyelesaian pembersih lensa kontak hanya satu

Untuk sumber DNA: Apa-apa pun dengan sel-sel atau sel hidup yang dipelihara oleh pembekuan seperti buah-buahan, sayur-sayuran, kekacang, kulat, daging dari kedai daging (lidah lembu beku berfungsi hebat!), Sumsum tulang dari tulang sup, dll.

Untuk mengekstrak DNA: Isopropyl (menggosok) alkohol (kaca 3) tanpa bahan tambahan dan sebagai pekat mungkin. Hancurkan botol di peti sejuk sebelum anda mula.

Sundries: Sebuah gelas minum untuk mencampurkan penampan, kontena kaca sempit kecil (sebaiknya dengan dinding lurus; tiub ujian adalah ideal, tetapi kaca tembakan akan dilakukan) untuk mengekstrak DNA, minum jerami sempit untuk menambah alkohol, tiub ujian lulus (atau yang biasa dan seorang pemerintah dengan skala sentimeter) untuk mengukur DNA, tongkat swizzle untuk mengeluarkan DNA.

Langkah Pertama: Bina Buffer

Pertama, anda perlu mencambuk penampan anda. Tuang 120 mililiter (kira-kira 4 auns) air sulingan atau botol ke dalam bekas kaca yang bersih. Tambah garam meja dan baking soda, dan kacau dengan kuat. Selepas mereka dibubarkan sepenuhnya, kacau di detergen. Syampu dan pencuci pakaian cecair yang mengandungi natrium lauril sulfat (semak label) berfungsi dengan baik.

Seterusnya, tambahkan pemanis daging dengan membasahi tusuk gigi, memasukkannya ke pemanis daging, dan memindahkannya ke penampan. Pemijet daging mengandungi enzim yang dipanggil papain yang memecahkan protein supaya mereka tidak akan keluar dengan DNA. Jus nanas dan penyelesaian pembersih lensa kontak juga mengandungi enzim yang menghancurkan protein, jadi, secara alternatif, anda boleh menambah setitik salah satu daripada 2 cecair ini.

Terakhir, kerana DNA merosot dengan cepat (kadang-kadang dalam masa beberapa minit), anda akan mahu memperlahankan laju kemusnahan dengan menyejukkan penampan di dalam bilik mandi ais yang dihancurkan. Sekiranya penimbal menjadi berawan, anda terlalu sejuk. Dalam kes itu, panaskannya cukup untuk membersihkannya.

Langkah Dua: Dapatkan DNA

Untuk sumber DNA, cubalah pantri. Anda boleh mendapatkan hasil yang hebat dengan bawang mentah, bawang putih, pisang, atau tomato. Tetapi itu percubaan anda; pilih buah kegemaran anda sendiri, sayuran, daging (segar atau beku), atau kulat.

Sebaik sahaja anda memperoleh sumber DNA anda, anda perlu memproses sel-selnya untuk mengekstrak molekul organiknya. Pertama, gunakan pisau untuk mengikat bahan menjadi kepingan kecil. Letakkan bahan itu ke dalam pengisar dan tuangkan hanya air sulingan atau botol yang cukup untuk menutupi ketulan. Kemudian putus (atau lyse, sebagai ahli biologi berkata) sel-sel dengan menghidupkan bilah-bilah dalam pecahan yang pendek sehingga anda telah mengadun bahan menjadi jisim lembam. Ini akan membuka beberapa sel secara langsung dan mendedahkan lebih banyak dinding sel dan nuklei kepada serangan detergen.

Akhirnya, anda perlu melepaskan molekul organik. Letakkan 5ml (1 sudu teh) bubur cincang ke dalam bekas bersih. Campurkan dalam 10ml (2 sudu kecil) penimbal sejuk anda. Swirl perlahan selama 2 minit, dan keberanian sel-sel yang pecah itu akan memisahkan diri ke buffer yang utuh. Sekiranya anda terlalu kuat, anda akan memecah beberapa DNA.

Langkah Tiga: Dump the Gunk

Seterusnya, anda akan mahu memisahkan senjata api pepejal dari sup muatan molekul. Ini lebih baik dilakukan dengan centrifuge. Sekiranya anda tidak mempunyai akses kepada satu, anda boleh membina sendiri dari pengisar dapur lama. (Untuk mengetahui bagaimana, lihat "A Kitchen Centrifuge" di halaman Unduh Tail-Kicking saya scifair.org). Jika anda memilih laluan ini, berputar pada kelajuan rendah selama 2 minit.

Jika anda tidak mempunyai centrifuge berbohong dan tidak mahu membina, ada pilihan yang lebih mudah, seperti kaki stoking nylon lama. Hanya memotong 6 inci dari kaki, lepaskan kaki ke kaca minum bersih atau balang, meregangkan kain melintasi pembukaan, dan tuang kaldu molekul anda melalui. Kain peregangan akan berpaut ke kaca dan mesh halus membuat penapis yang indah.

Langkah Empat: Ekstrak DNA

Apabila anda telah mengeluarkan cecair dari pistol, hati-hati tuangkan sekurang-kurangnya 5ml (1 sudu teh) cecair ke dalam vakum sempit, seperti kaca pukulan bersih, botol plastik yang jelas, atau tiub ujian. (Jika anda menggunakan kapal yang lebih besar daripada tiub ujian, anda perlu lebih banyak cecair. Gunakan cukup untuk mengisi bekas sekurang-kurangnya satu suku penuh.) Anda kini bersedia untuk memujuk molekul DNA untuk melekat bersama dan gugur penyelesaiannya.

Ingat, DNA hanya digantung di penampan kerana ion garam menghalang molekul gergasi negatif raksasa ini daripada melekat bersama. Sekarang, anda sudah bersedia untuk mengurangkan kepekatan garam secukupnya untuk membiarkan molekul DNA bergumpal dan gugur dari larutan.

Keluarkan alkohol sejuk anda dari peti sejuk. Sepanjang bahagian dalam bekas, anda perlu berhati-hati menuangkan jumlah alkohol yang sama seperti yang anda ada penimbal, supaya alkohol itu perlahan-lahan diikat di atas penampan DNA anda. Untuk melakukan ini, tempurkan jerami minum sempit ke dalam botol alkohol dan kemudian laraskan bahagian atas jerami dengan jari anda untuk menangkap alkohol. Tanggalkan jerami, miringkan kaca, dan sentuh hujung ke bahagian dalam kaca. Kemudian, biarkan alkohol mengalir di sepanjang sisi. Kerana alkohol kurang padat daripada penampan, ia akan terapung di atas. Jika anda mempunyai tangan yang sangat mantap, anda juga boleh melakukan langkah ini dengan perlahan-lahan menuangkan alkohol ke dalam bekas dengan menuangkan larutan ke bawah di sepanjang pensil ke dalam bekas.

Di mana kedua-dua cecair bertemu, enapcemar gelatin akan tiba-tiba muncul. Lumpur itu adalah DNA!

Pada ketika ini, anda harus melihat 3 lapisan yang berlainan: alkohol di bahagian atas, enap cemar DNA di bawah itu, dan penimbal di bahagian bawah. DNA mestilah muncul sebagai filamen berturut-turut yang melekat bersama. Jika, sebaliknya, ia kelihatan sebagai serpihan serpihan serpihan terapung, sesuatu berlaku untuk memecah molekul. Anda masih dapat mengukur jumlahnya, tetapi anda mungkin tidak dapat mengeluarkannya untuk belajar.

Penampan Buffer

Di makmal, saintis sering menggunakan natrium dodecyl sulfate deterjen, atau SDS, untuk mengeluarkan DNA dari sel. SDS juga biasa dalam syampu dan bahan pencuci isi rumah, di mana ia pergi dengan nama natrium lauril sulfat.

Para saintis juga menggunakan garam meja - natrium klorida tulen - tanpa bahan tambahan. Morton ("Apabila turun hujan, ia menuangkan") menambah kalsium silikat kepada garamnya untuk mengelakkan kelembapan yang tinggi. Tetapi terlalu banyak kalsium (atau magnesium) boleh bertindak balas untuk menumbuhkan penampan anda dengan "sabun sabun" putih, terutamanya jika anda menggunakan sabun dan bukan detergen. Anda boleh menggunakan sabun cair, tetapi anda memerlukan garam tanpa sebatian kalsium atau magnesium ditambah (baca label). Garam pelembut air (kedua-dua natrium klorida dan kalium klorida) berfungsi dengan baik. Jika tidak, gunakan detergen dan garam meja.

Para saintis juga menggunakan air suling tetapi air botol akan berfungsi dengan baik. Jangan gunakan air paip kerana ia dimuatkan dengan ion yang tidak diingini dan (sering) lebih teruk, klorin, yang memusnahkan DNA pada sentuhan.

DNA pencelupan

Sesetengah pewarna mengikat langsung kepada DNA. Menambah drop atau dua untuk penyelesaian akan mencemarkan enap cemar telus supaya anda boleh melihat keseluruhan panen anda dengan mudah. Yang paling selamat untuk kegunaan rumah adalah metilena biru. Ia bukan toksik, dan kerana ia digunakan untuk merawat penyakit tertentu dalam ikan, anda boleh menemuinya di banyak kedai bekalan akuarium yang lengkap. Ia biasanya datang sebagai penyelesaian 2.3%. Noda DNA yang betul adalah kira-kira satu larutan 1%, jadi anda akan mahu mencairkannya dengan menambah jumlah yang sama botol atau air sulingan.

Mengambil Lebih Lanjut: Eksperimen DNA

Terdapat dua jenis eksperimen yang sangat mudah dilakukan, dan saya mengesyorkan bahawa walaupun eksperimen paling mencabar bermula dengan salah satu daripada ini: menemui berapa banyak DNA boleh diekstrak daripada organisma yang berlainan dalam keadaan yang berbeza, dan meneroka keadaan yang menyebabkan DNA merendahkan.

Mengukur jumlah DNA yang telah anda hasilkan dari sampel tidak dapat lebih mudah. Pertama, ukur diameter dalam bekas bertetulang lurus anda yang memegang DNA. Sebaik sahaja anda tahu nombor itu, ukur mengukur ketebalan enapcemar. Dengan maklumat itu, mudah untuk mengira volum DNA yang anda hasilkan: persamaannya adalah V = ΠD2T / 4, di mana D adalah diameter dalaman kapal dan T adalah ketebalan lapisan enapcemar DNA. Seterusnya, bahagikan jumlah DNA yang diekstrak dengan sama ada jumlah atau jisim bahan yang diperolehnya. Cara paling mudah untuk melakukan itu adalah dengan tepat mengukur berapa banyak bubur yang anda masukkan ke penampan anda, dan kemudian memproses semua penampan untuk mengeluarkan setiap sekeping DNA yang terlelap ke dalamnya. Jika anda mempunyai skala yang tepat, timbanglah sampel anda sebelum memprosesnya. Jika tidak, ukur mengukur jumlah bahan sebelum anda mengadunnya.

Contoh: Katakan anda memproses 5g bawang ke dalam 10ml buffer dan diekstrak 1ml DNA. Berapa banyak DNA yang anda dapat dari setiap gram bawang? Mudah! Hanya membahagikan apa yang anda dapat dengan apa yang anda bermula dengan: 1ml DNA / 5g bawang = 0.2ml / g.

Anda juga boleh menjalankan eksperimen dengan DNA itu sendiri. Biasanya, langkah pertama adalah menghapus enapcemar DNA. Ia mengambil sedikit amalan, tetapi anda boleh melakukannya dengan menggunakan kaca bersih dan tongkat swizzle. Perlahan masukkan batang melalui lapisan alkohol dan pusarnya perlahan-lahan ke arah yang sama, dengan hujung digantung di bawah bahagian atas larutan penampan. Potongan-potongan DNA yang lebih panjang akan menjalar ke dalam kaca, meninggalkan molekul yang lebih kecil di belakang.

Selepas satu minit berpusing, perlahan-lahan tarik pengaduk itu melalui alkohol. Ini akan membuat DNA mematuhi akhir batang, di mana ia akan muncul sebagai gumpalan yang telus, likat, "gumpalan" yang berpaut pada hujungnya.

Sekiranya anda menebus kembali molekul dalam penampan segar, anda boleh mendedahkannya kepada bahan kimia, cahaya matahari, suhu, atau apa-apa lagi yang boleh memecahkan DNA. Buat batch baru betul-betul seperti sebelum dan berehat, tetapi jangan repot-repot menambah detergen. Gosokkan batang swizzle dan tempuh perlahan selama beberapa minit kerana DNA larut ke dalam penampan. Kemudian bahagikan penyangga sama ke dalam 2 bekas kaca bersih. Paparkan satu - sampel ujian anda - untuk ejen apa yang anda ingin ujian. Tinggalkan yang lain - kawalan anda - bersendirian. Kemudian proses kedua secepat mungkin dan bandingkan jumlah DNA yang anda boleh ekstrak dari setiap penampan. Perbezaan antara jumlah ujian dan kawalan anda ialah ukuran berapa banyak yang merosakkan agen anda terhadap DNA.

Sekiranya ini terlalu mudah, ingat bahawa DNA adalah perkara yang rapuh dan ia boleh terjejas oleh banyak perkara yang halus yang mungkin melarikan diri dari notis anda. Mendapatkan hasil yang konsisten mengambil amalan, jadi pastikan anda mengubah pendedahan itu dan data diplotah anda menunjukkan tingkah laku biasa sebelum membuat sebarang kesimpulan.

Penyimpanan Sejuk: Ia sebenarnya mudah untuk menyimpan DNA anda untuk kegunaan kemudian. Hanya letakkan "bola sabit," tongkat dan semua, dalam bekas yang dipenuhi dengan isopropil alkohol ais dan letakkan di dalam penyejuk beku. DNA anda akan kekal hampir selama-lamanya.

Perihal Penulis: Dr. Shawn (Shawn Carlson, Ph.D.) adalah Fellow MacArthur dan pengasas dan pengarah eksekutif Persatuan Ahli-ahli sains Amatur. Untuk mengetahui lebih lanjut mengenai masyarakat, lawati sas.org.

Kongsi

Meninggalkan Komen